Кварцевая кювета для УФ-Вис и стеклянная кювета: пропускание, точность и особенности материалов

Выбор неподходящего материала для кюветы незаметно искажает спектроскопические данные — и большинство исследователей обнаруживают эту ошибку только тогда, когда результаты становятся необъяснимыми.

Материал кюветы — это не второстепенный фактор в УФ-Вид-спектроскопии; это основополагающая переменная, которая напрямую определяет, отражают ли показания поглощения химический состав образца или являются следствием артефактов прибора. В данной статье рассматриваются оптические, структурные, химические и эксплуатационные свойства, благодаря которым кварц является эталонным материалом для УФ-Вид-измерений, а также проводится систематическое сравнение его характеристик с характеристиками стекла, пластика и сапфира во всем спектральном диапазоне.

Выбор материала в спектроскопии начинается с понимания того, какие требования прибор фактически предъявляет к сосуду, в котором находится образец. Когда УФ-Вид-спектрофотометр сканирует диапазон длин волн от 190 нм до 800 нм, каждый оптический элемент в пути прохождения света — включая кювету — должен пропускать излучение, не поглощая, не рассеивая и не вызывая флуоресценции. Кювета, которая создаёт помехи для луча на любой длине волны в пределах этого диапазона, вносит систематическую погрешность, которую невозможно исправить только с помощью программной постобработки.

---

Оптическая прозрачность окна определяет выбор материала кюветы

Каждый оптический материал избирательно пропускает излучение, и границы этой избирательности определяют, подходит ли кювета для проведения исследований в УФ-Видимом диапазоне с научной точки зрения или же она принципиально несовместима с ними.

Что такое окно пропускания в оптических материалах

Окно пропускания — это диапазон длин волн, в котором материал пропускает электромагнитное излучение без значительного затухания. Ослабление обусловлено тремя взаимоисключающими явлениями: поглощением, отражением и рассеянием, каждый из которых вносит свой вклад в потерю сигнала в зависимости от длины волны.

На атомном уровне поглощение происходит, когда энергия падающего фотона соответствует ширине энергетической щели между основными и возбужденными состояниями электронов в молекулярной или кристаллической структуре материала. Материалы с широкой электронной запрещенной зоной — в которых энергия, необходимая для перехода электронов в возбужденные состояния, превышает энергию УФ-фотонов — демонстрируют широкие окна пропускания в коротковолновом диапазоне. Напротив, материалы, содержащие ионы переходных металлов, сопряжённые органические структуры или структурные дефекты, обладают промежуточными электронными энергетическими состояниями, которые легко поглощают УФ-излучение, эффективно блокируя пропускание ниже своих характерных граничных длин волн.

Практическое значение этого для выбора кюветы очевидно: любой материал, граница поглощения которого находится в спектральном диапазоне измерения, накладывает свой собственный профиль поглощения на сигнал образца, что делает невозможной точную коррекцию базовой линии.

Спектральный диапазон УФ-Вид и предъявляемые к нему высокие оптические требования

Спектральный диапазон УФ-Вид обычно простирается от от 190 нм до 800 нм, подразделяющийся на области глубокого УФ (190–280 нм), ближнего УФ (280–400 нм) и видимого спектра (400–800 нм). Каждая из этих подобластей предъявляет свои особые требования к прозрачности материала кюветы.

Видимый диапазон (400–800 нм) является относительно непредъявляющим высоких требований; как стекло, так и кварц обеспечивают достаточную пропускаемость в этом диапазоне, благодаря чему выбор материала не играет столь важной роли для колориметрических анализов, проводимых исключительно в видимом диапазоне. Однако в ближнем УФ-диапазоне (280–400 нм) начинают проявляться ограничения стекла и большинства полимеров, поскольку границы их поглощения простираются от значений ниже 320 нм и выше. Самым требовательным является дальний УФ-диапазон (190–280 нм): Менее трёх коммерчески применимых материалов для кювет — плавленый кварц, синтетический кварц УФ-класса и сапфир — обладают достаточной прозрачностью в диапазоне длин волн ниже 220 нм.

Количественное определение белков при 280 нм, количественное определение нуклеиновых кислот при 260 нм, поглощение пептидных связей при 215 нм и определение характеристик ароматических аминокислот в диапазоне 250–290 нм — все эти процессы относятся к ближнему УФ-диапазону или находятся вблизи него. Для этих задач, которые составляют значительную долю рутинных лабораторных спектроскопических исследований, Прозрачность материала кюветы в диапазоне длин волн ниже 320 нм является обязательным требованием.

---

Как оптические свойства кварцевых кювет влияют на результаты измерений в УФ-Вид-диапазоне

Одной лишь оптической прозрачности недостаточно, чтобы полностью объяснить, почему измерения в УФ-Вид-диапазоне настолько существенно выигрывают от кварцевая кювета конструкция. Преимущества простираются от молекулярной структуры до точности изготовления и качества поверхности.

Молекулярная структура плавленого кремнезема и его прозрачность в УФ-диапазоне

Кварцевое стекло — основной материал, используемый в кварцевых кюветах для УФ-Вид спектрофотометрии, — представляет собой аморфное твердое вещество, состоящее исключительно из диоксида кремния (SiO₂), организованного в непрерывную случайную сеть тетраэдров [SiO₄] с общими вершинами. В отличие от кристаллического кварца, который обладает упорядоченной решеткой с дальнодействующими связями, у плавленого кварца отсутствует периодическая регулярность структуры, что устраняет двулучепреломление и делает его оптически изотропным при любой ориентации.

Электронная структура связи Si–O играет ключевую роль в пропускании ультрафиолетового излучения плавленым кварцем. Ширина запрещенной зоны плавленого кварца высокой чистоты составляет примерно 8,9 эВ, что соответствует началу поглощения вблизи 140 нм в области вакуумного УФ-излучения. Фотоны с длиной волны 190 нм обладают энергией примерно 6,5 эВ — что значительно ниже порога, необходимого для возбуждения электронов через запрещенную зону Si-O, — а это означает, что УФ-излучение с длинами волн, актуальными для лабораторной спектроскопии, проходит через чистый плавленый кварц без электронного поглощения. Это резко контрастирует с многокомпонентными стеклами, в которых оксиды легирующих примесей создают электронные состояния ниже ширины запрещенной зоны, которые поглощают УФ-излучение на длинах волн до 350 нм.

Синтетический плавленый кварц, полученный методом пламенного гидролиза или плазменного CVD с использованием SiCl₄, позволяет достичь концентрации гидроксильных групп (OH) ниже 1 ppm и уровня металлических примесей ниже 20 ppb, оба из которых имеют решающее значение для обеспечения пропускания УФ-излучения. Натуральные кристаллы кварца даже после очистки сохраняют следовые примеси, которые вызывают появление полос поглощения вблизи 245 нм (связанных с центрами, лишенными кислорода) и 214 нм (связанных с центрами E'), что делает их менее пригодными для применения в области глубокого УФ-излучения по сравнению с синтетическим плавленым кварцем.

Диапазон пропускания кварцевой кюветы от глубокого ультрафиолета до ближнего инфракрасного диапазона

Кварц высокой чистоты демонстрирует измеримую пропускаемость в диапазоне примерно от от 170 нм до 2 700 нм, охватывая спектральный диапазон, с которым ни один другой экономически выгодный оптический материал не может сравниться в полном объеме. В частности, в области УФ-Вид (190–800 нм) значения пропускания для кюветы из плавленого кварца УФ-класса с длиной пути 10 мм, как правило, превышают 85% при 200 нм и 92% при 250 нм, причем потери обусловлены в основном отражением по Френелю на двух границах раздела «воздух-стекло», а не поглощением в объёме материала.

Три коммерческих сорта кювет из плавленого кварца различаются в первую очередь по содержанию гидроксильных групп и связанному с этим поглощению в ИК-диапазоне. Плавленый кварц УФ-класса (с низким содержанием OH, < 10 ppm OH) обеспечивает оптимальную пропускаемость в диапазоне ниже 250 нм, что делает его подходящим выбором для спектроскопии в области глубокого УФ. Кремнезем плавленый стандартного качества (с высоким содержанием OH, 400–1 000 ppm OH) демонстрирует слегка пониженную пропускаемость в УФ-диапазоне из-за обертонов поглощения OH вблизи 245 нм, но при этом обеспечивает приемлемые характеристики для большинства применений в ближнем УФ-диапазоне выше 220 нм. Кварцевое стекло ИК-класса оптимизирует пропускание в диапазоне 2 000–3 500 нм за счёт некоторого снижения характеристик в УФ-диапазоне.

Для количественного определения нуклеиновых кислот и белков — двух наиболее распространенных областей применения УФ-Вис-спектроскопии в биологических лабораториях — кюветы из плавленного кварца УФ-класса с длиной пути излучения 10 мм обеспечивают значения фоновой поглощающей способности ниже 0,01 АЕ при 260 нм и 280 нм, обеспечивая необходимый диапазон измерения для точного количественного определения в широком диапазоне концентраций.

Однородность показателя преломления и качество поверхности у кварцевых кювет различных марок

Показатель преломления плавленого кварца при длине волны 589 нм (линия D натрия) составляет примерно 1.458, с профилем дисперсии, который предсказуемо изменяется от 1,534 при 193 нм до 1,440 при 1 064 нм. Более важным, чем абсолютное значение показателя преломления, является его пространственная однородность по всему оптическому окну кюветы: Высококачественные заготовки из плавленого кварца демонстрируют однородность показателя преломления, не превышающую ±5 × 10⁻⁶, что гарантирует, что искажение волнового фронта, вызванное стенками кюветы, является пренебрежимо малым по сравнению с фотометрической точностью прибора.

Качество обработки поверхности напрямую определяет потери на рассеяние на стенках кюветы. При полировке плавленого кварца до оптического качества достигаются значения шероховатости поверхности ниже 0,5 нм RMS (среднеквадратичное значение), что позволяет удержать потери на поверхностном рассеивании на уровне ниже 0,11 TP3T во всем диапазоне УФ-Вид. Полировка в соответствии с этими требованиями требует многоступенчатой шлифовки с использованием абразивов, становящихся все мельче, с последующей полировкой смолой или магнитореологической финишной обработкой — процессов, характерных для производства оптических изделий и отличающихся от стандартного производства лабораторной стеклянной посуды.

Двусторонние кюветы для полировки — при которых оптическая обработка выполнена только на двух гранях, перпендикулярных лучу света, — вполне подходят для стандартных измерений поглощения. Четырехсторонние кюветы для полировки, где все четыре вертикальные грани имеют одинаковую оптическую обработку, необходимы для флуоресцентной спектроскопии, циркулярный дихроизм (CD)¹, а также измерения оптического вращения, при которых излучение поступает или выходит через боковые грани.

Краткий обзор оптических характеристик кварцевых кювет

Параметр	Плавленый кварц УФ-класса	Стандартный кварц	Кремнезем плавленый класса IR
Диапазон пропускания (нм)	170–2 700	190–2 700	220–3 500
Содержание OH (ppm)	< 10	400–1 000	< 10
Пропускание при длине волны 200 нм (%)	> 85	75–85	60–75
Пропускание при длине волны 260 нм (%)	> 92	> 90	> 88
Показатель преломления при 589 нм	1.458	1.458	1.458
Среднеквадратичное значение шероховатости поверхности (нм)	< 0.5	< 0.5	< 0.5
Металлические примеси (ppb)	< 20	< 50	< 20

---

Выбор длины пути в кварцевых кюветах для УФ-Вис-спектрофотометрии и его влияние на точность измерений

Помимо прозрачности материала, длина пути в кварцевой кювете для УФ-Вид-спектрофотометрии является наиболее значимым геометрическим параметром, влияющим как на точность, так и на линейный динамический диапазон измерений поглощения.

Закон Бира-Ламберта и линейная зависимость от длины пути

Закон Бера-Ламберта описывает фундаментальную зависимость между оптической плотностью, концентрацией раствора и длиной оптического пути: A = ε × c × l, где A — оптическая плотность (безразмерная величина), ε — молярный коэффициент ослабления (Л·моль⁻¹·см⁻¹), c — молярная концентрация (моль·л⁻¹), а l — длина пути (см). Этот закон предсказывает строго линейную зависимость между поглощением и концентрацией при фиксированной длине пути, а также между поглощением и длиной пути при фиксированной концентрации — однако эта линейность сохраняется только в определённом диапазоне.

Отклонения от линейности закона Бера-Ламберта становятся заметными, когда значения поглощения превышают примерно 1,5 АЕ (что соответствует коэффициенту пропускания ниже 3,2%). При высокой оптической плотности доля рассеянного света внутри спектрофотометра — излучения, которое попадает на детектор, не проходя через образец, — составляет пропорционально большую часть регистрируемого сигнала, в результате чего кажущаяся оптическая плотность достигает плато ниже своего истинного значения. Кроме того, при высоких концентрациях растворенного вещества межмолекулярные взаимодействия между поглощающими частицами изменяют эффективный молярный коэффициент ослабления, что приводит к химическим отклонениям от линейности. Оба эффекта приводят к систематической заниженной оценке истинной концентрации, причем погрешности достигают 5–15% при значениях поглощения выше 2,0 AU.

Уменьшение длины пути прохождения света — это физически точный метод восстановления линейности при работе с концентрированными образцами. Уменьшение длины пути прохождения света вдвое — с 10 мм до 5 мм — приводит к уменьшению измеренной оптической плотности вдвое при постоянной концентрации, что позволяет вернуть измерения в линейный диапазон без необходимости разбавления образца — это является важнейшим преимуществом в случаях, когда объемы образцов ограничены или когда разбавление может нарушить равновесие в растворе.

Стандартные длины пути в кварцевых кюветах и соответствующие области их применения

Производители выпускают кварцевые кюветы для УФ-Вис-спектрофотометрии с длиной пути излучения в диапазоне, составляющем примерно три порядка величины, от 0,1 мм до 100 мм, чтобы учесть все разнообразие концентраций образцов, встречающихся в аналитической практике.

Кюветы с короткой длиной пути — 0,1 мм, 0,2 мм и 0,5 мм — используются для образцов с высокой концентрацией, таких как неразбавленные запасные растворы белков, концентрированные растворы красителей и фармацевтические препараты в технологических концентрациях. При длине пути излучения 0,1 мм образец с молярным коэффициентом ослабления 10 000 л·моль⁻¹·см⁻¹ остается в линейном диапазоне при концентрациях до примерно 150 мг/мл для типичного глобулярного белка — диапазон, недоступный при использовании стандартных 10-миллиметровых кювет. Данный Длина пути 10 мм Кювета является универсальным стандартом для рутинных измерений в УФ-Вид-диапазоне, обеспечивая практический рабочий диапазон поглощения примерно от 0,05 до 1,5 АЕ для большинства лабораторных образцов. Кюветы с большой длиной пути из 20 мм, 50 мм и 100 мм расширить диапазон чувствительности до образцов со следовыми концентрациями, включая пробы водных объектов, анализируемые на наличие ароматических загрязнителей, сверхразбавленные стандарты фармацевтических примесей и хромофорные соединения с низкой концентрацией в экологических исследованиях.

Микро- и субмикрокварцевые кюветы для УФ-Вис-анализа ограниченных объемов

Ограничения по объему проб, особенно характерные для геномики, протеомики и биологии отдельных клеток, послужили стимулом для разработки микро- и субмикроформатов кварцевых кювет, которые сохраняют полные оптические характеристики при значительно меньших объемах.

Для стандартной кварцевой кюветы с длиной пути 10 мм требуется примерно 3,0–3,5 мл объёма образца, необходимого для заполнения оптической камеры над траекторией луча. Полумикро-кюветы позволяют снизить это требование до 1,4–1,7 мл путем уменьшения ширины внутренней камеры при сохранении длины пути 10 мм. Микрокуветы позволяют ещё больше сократить требуемый объём до 0,6–0,7 мл, а субмикронные форматы позволяют получать пригодные для использования результаты измерений уже при 70 мкл, что достигается за счет создания чрезвычайно узкой внутренней камеры (обычно с поперечным сечением 3 мм × 3 мм) с точно заданным значением параметра Z — высотой центра луча над дном кюветы — соответствующим оптической геометрии спектрофотометра.

Z-координата является важнейшим параметром совместимости: у большинства настольных УФ-Вид-спектрофотометров центр луча располагается на 8,5 мм над основанием кюветы, тогда как в некоторых приборах используются значения Z-размера 15 мм или 20 мм. Несоответствие между размером кюветы по оси Z и высотой луча прибора приводит к тому, что луч частично проходит мимо объема образца, что вызывает аномально низкие показания поглощения, которые без независимой проверки невозможно отличить от подлинных сигналов низкой концентрации.

Эталонные значения длины пути и объёма кварцевых кювет

Длина пути (мм)	Типичный объем пробы (мл)	Первичное применение
0.1	0.05-0.15	Высококонцентрированные белковые растворы, растворы активных фармацевтических ингредиентов (API)
0.5	0,10–0,30	Концентрированные биологические экстракты
1	0,40–0,70	Пробы со средней концентрацией
10	3,00–3,50	Стандартные процедуры измерений в УФ-Вис-диапазоне
20	6.00–7.00	Разбавьте пробы окружающей среды
50	15,0–17,0	Анализ следовых примесей
100	30,0–35,0	Измерение концентраций в ультраследовых количествах

---

Вариации геометрической конструкции кварцевых кювет для экспериментальных установок в УФ-Вид-диапазоне

Характеристики длины пути и объёма описывают явления, происходящие вдоль главной оптической оси, однако геометрия самого корпуса кюветы вносит дополнительные переменные, которые влияют на качество измерений в определённых экспериментальных конфигурациях.

Четырёхсторонние и двухсторонние полированные кюветы

Двусторонние полированные кюветы имеют оптически ровные поверхности без царапин исключительно на двух гранях, перпендикулярных лучу возбуждения, — именно по этим граням и проходит измеряемое излучение. Остальные две боковые грани отшлифованы до матового состояния, что достаточно для обеспечения механической устойчивости и удобства обращения, но с оптической точки зрения непригодно для пропускания излучения. Двусторонние кюветы для полировки вполне подходят для стандартных измерений поглощения где излучение поступает через одну отполированную поверхность и выходит через противоположную отполированную поверхность вдоль одной линейной оптической оси.

Четырёсторонние полированные кюветы имеют одинаковую оптическую обработку на всех четырёх вертикальных гранях, что позволяет излучению проникать внутрь или выходить наружу через любую грань без потерь на рассеяние. Такая конструкция незаменима для флуоресцентная спектроскопия, где возбуждающее излучение поступает через одну грань, а излучаемая флуоресценция улавливается под углом 90° через соседнюю грань. Это в равной степени необходимо для спектроскопия циркулярного дихроизма (CD), где геометрия взаимодействия зависит от точного управления поляризацией с помощью оптически однородных поверхностей, а также для измерения оптического вращения. Дополнительные затраты на изготовление, связанные с полировкой четырёх граней вместо двух, — как правило, составляют 30–50% премиум-класса по сравнению с эквивалентными спецификациями двусторонней полировки — оправдано лишь в том случае, если геометрия измерения требует бокового оптического доступа.

Практический метод идентификации: у двусторонних полированных кювет при рассмотрении под косым освещением на боковых стенках обычно наблюдается видимая непрозрачность или матовый вид, тогда как четырехсторонние полированные кюветы выглядят одинаково прозрачными со всех сторон.

Кюветы из кварца с чёрными стенками и подавление паразитного света при флуоресцентных измерениях

Стандартные четырехсторонние кюветы для полирования, хотя и обеспечивают оптический доступ со всех сторон, приводят к появлению специфического артефакта при измерении флуоресценции: отраженное возбуждающее излучение от внутренних стенок кюветы попадает на детектор излучения, в результате чего на спектр истинной флуоресценции накладывается фоновый сигнал. Этот артефакт особенно выражен при длинах волн излучения, близких к длине волны возбуждения — в области пика Рамановского рассеяния воды и в начальной части полосы флуоресцентного излучения.

Кварцевые кюветы с чёрными стенками позволяют устранить этот артефакт за счёт применения непрозрачное чёрное покрытие на двух боковых и задней поверхностях, при этом прозрачными и отполированными остаются только передняя поверхность (входная для возбуждающего излучения) и поверхность излучения под углом 90°, что позволяет черному покрытию поглощать отраженное и рассеянное возбуждающее излучение до того, как оно достигнет детектора излучения, снижая фон паразитного света на в 10–100 раз по сравнению со стандартными четырехгранными полированными кюветами, используемыми в флуоресцентных экспериментах. Корпус кюветы с чёрными стенками изготовлен из кварца, соответствующего требованиям к УФ-прозрачности; отличается лишь покрытие внешней поверхности.

Практическим следствием использования стандартной кюветы с прозрачными стенками вместо кюветы с чёрными стенками в флуоресцентной спектроскопии является повышенный и спектрально структурированный фоновый сигнал что снижает чувствительность, искажает спектры излучения в диапазоне длины волны примерно 30–50 нм от длины волны возбуждения и ухудшает точность количественных измерений для слабофлуоресцирующих образцов.

Варианты конструкции кварцевых кювет и их применение

Тип конструкции	Полированные лица	Управление рассеянным светом	Первичное применение
Двусторонняя полировка	2 (спереди и сзади)	Стандарт	Поглощение в УФ-Вид-области
Полировка с четырех сторон	4 (все вертикальные)	Стандарт	Флуоресценция, спектроскопия круговой дифракции (CD)
С чёрными стенками	2 (передняя часть + поверхность излучения)	Расширенный	Флуоресценция с низким фоном
Проточный	2 или 4	Стандарт	Детекторы для ВЭЖХ, с непрерывным потоком
Цилиндрический	Непрерывная кривая	Ограниченный	Специализированный круговой дихроизм

---

Характеристики химической стойкости кварцевых кювет для УФ-Вис-спектрофотометрии в различных матрицах образцов

Спектроскопические преимущества кварца из плавленого кремнезема сопровождаются не менее важным преимуществом в виде химической стойкости, которая определяет спектр образцов, которые можно безопасно помещать в кювету без ухудшения качества её оптических поверхностей.

Совместимость плавленого кремнезема с кислотами и органическими растворителями

Химическая стойкость к кислотам и органическим растворителям плавленого кварца напрямую обусловлена термодинамической стабильностью сети Si-O-связей. Энергия диссоциации связи Si-O составляет примерно 452 кДж/моль превышает прочность большинства металл-кислородных связей в многокомпонентных стеклах, что объясняет, почему плавленый кварц устойчив к воздействию реагентов, которые легко разъедают обычную лабораторную стеклянную посуду.

Сильные минеральные кислоты — в том числе соляная кислота любой концентрации, серная кислота с концентрацией до примерно 70%, азотная кислота и фосфорная кислота при комнатной температуре — не оказывают заметного разрушающего воздействия на поверхности из плавленого кварца в течение типичных лабораторных сроков воздействия. Водные кислые буферы, обычно используемые в биохимии (цитратные, ацетатные, фосфатные и MES-буферы с pH 3–6), также безвредны. Органические растворители демонстрируют столь же широкий диапазон совместимости: этанол, метанол, изопропанол, ацетон, ацетонитрил, диметилсульфоксид (ДМСО), дихлорметан, хлороформ, толуол и тетрагидрофуран (ТГФ) все они совместимы с кюветами из плавленого кварца и не вызывают их разбухания, выщелачивания или ухудшения оптических свойств поверхности.

Важное практическое различие отличает кварц из плавленого кремнезема от полимерных материалов, из которых изготавливаются кюветы: органические растворители, вызывающие немедленное появление трещин, помутнение или растворение кювет из ПММА или полистирола — в особенности хлорированные растворители, кетоны и ароматические углеводороды — не оказывают никакого влияния на кварц, что делает кюветы из плавленого кварца единственным практичным выбором для УФ-Вид-измерений в системах с неводными растворителями.

Особое исключение, касающееся фтористоводородной кислоты и концентрированных щелочей

Несмотря на широкую химическую совместимость, кварц из плавленого кремнезема имеет два четко выраженных химических недостатка, которые необходимо без исключения учитывать в лабораторной практике.

Фтористоводородная кислота (HF) вступает в реакцию с SiO₂ по стехиометрической реакции SiO₂ + 4HF → SiF₄↑ + 2H₂O, выделяя летучие вещества тетрафторид кремния² и водой. Эта реакция протекает с измеримой скоростью даже при концентрации HF всего 0,1% и при комнатной температуре, вызывая коррозию полированных оптических поверхностей кварцевых кювет в течение нескольких минут после контакта. Коррозия поверхности приводит к появлению необратимых потерь на рассеяние и искажению волнового фронта, которые невозможно устранить путем очистки; Кварцевую кювету, подвергшуюся воздействию фтористоводородной кислоты, следует считать безвозвратно поврежденной и вывести из эксплуатации. Концентрированный гидроксид натрия (NaOH > 30%) и гидроксид калия (KOH > 20%) воздействуют на плавленый кварц по более медленному механизму растворения — гидроксид-ионы гидролитически разрывают связи Si-O-Si, при этом скорость растворения составляет примерно 0,1–1 мкм в час при комнатной температуре в концентрированной щелочи. Концентрированная фосфорная кислота при температурах выше 100 °C также разъедает плавленый кварц со скоростью, которая резко возрастает с повышением температуры.

Для проб, требующих использования фтористоводорода, концентрированной щелочи или горячей концентрированной фосфорной кислоты, в качестве подходящих альтернативных сосудов следует использовать емкости из политетрафторэтилена (ПТФЭ) или перфторалкокси (ПФА), ни один из которых не вступает в реакцию с этими реагентами.

Химическая совместимость кювет из плавленого кварца

Класс реагентов	Пример	Совместимость	Примечания
Разбавленные минеральные кислоты	HCl, H₂SO₄, HNO₃	✓ Совместимо	Все концентрации, температура окружающей среды
Органические растворители	Этанол, ацетон, ДМСО, ХЛ₃	✓ Совместимо	Отсутствие набухания и ухудшения оптических характеристик
Водные буферные растворы (pH 3–9)	PBS, HEPES, цитрат	✓ Совместимо	Стандартный диапазон значений pH в биологических системах
Разбавленные щелочи (< 5%)	NaOH, KOH	⚠ Внимание	Медленная экспозиция; сократите время экспозиции до минимума
Концентрированные щелочи	NaOH > 30%	✗ Несовместимо	Растворение на поверхности в течение нескольких часов
Фтористоводородная кислота	HF (любая концентрация)	✗ Несовместимо	Мгновенное необратимое травление
Горячий концентрированный H₃PO₄	> 85%, > 100 °C	✗ Несовместимо	Термическое ускорение коррозии SiO₂

---

Почему стеклянные кюветы не подходят для УФ-Вис-измерений в диапазоне длин волн ниже 320 нм

Стеклянные кюветы по-прежнему повсеместно используются в учебных лабораториях и при колориметрии в видимом диапазоне, однако их спектроскопические ограничения в ультрафиолетовом диапазоне настолько серьезны, что делают их научно непригодными для значительной части аналитических задач.

Химический состав боросиликатного и натриево-известкового стекла

Коммерческие лабораторные стеклянные кюветы изготавливаются либо из боросиликатного стекла, либо из натриево-кальциевого стекла — двух многокомпонентных силикатных составов, в состав которых входят значительные доли некремнеземных веществ, формирующих кристаллическую решетку и модифицирующих свойства материала.

Боросиликатное стекло (например, Schott DURAN и Corning Pyrex) содержит примерно 81% SiO₂, 13% B₂O₃, 4% Na₂O и 2% Al₂O₃ по массе. Триоксид бора (B₂O₃) добавляется для снижения коэффициента теплового расширения, что повышает стойкость к термическим ударам, однако структуры, состоящие из атомов бора и кислорода, приводят к появлению электронных переходов в ультрафиолетовом диапазоне, которых нет в чистом SiO₂. Стакан с содовой обычно содержит 72% SiO₂, 14% Na₂O, 9% CaO и 5% MgO — состав, оптимизированный с точки зрения технологичности и стоимости, а не оптических характеристик. Оксиды-модификаторы решетки (Na₂O, CaO, MgO) нарушают структуру Si-O-решетки, создавая немостиковые участки кислорода, которые образуют дефектные центры, поглощающие УФ-излучение.

Следовые примеси металлов в обоих типах стекла — в частности, ионы Fe²⁺ и Fe³⁺, содержащиеся в стандартном оптическом стекле в концентрациях 50–200 ppm — дают интенсивные полосы поглощения УФ-излучения. Fe³⁺ дает полосы поглощения вблизи 225 нм и 320 нм за счет d-d-переходы в поле лиганда³ а также переходы с переносом заряда, в то время как Fe²⁺ обеспечивает поглощение вблизи 200 нм. Даже при концентрациях менее 100 ppm на длине пути 10 мм эти полосы поглощения железа дают вклад в поглощение в размере 0,1–0,5 AU при 280 нм — величины, которые перекрывают сигналы разбавленных биологических образцов.

Предел поглощения ультрафиолета стеклом и его спектроскопические последствия

Предел поглощения ультрафиолета материалом кюветы условно определяется как длина волны, при которой собственное поглощение материала равно 1,0 а.е. при длине пути 10 мм — точка, в которой пропускается лишь 10% падающего излучения, а отношение сигнал/шум ухудшается до уровня, при котором количественные измерения становятся недостоверными.

Для боросиликатного стекла эта предельная длина волны находится в диапазоне от 290 и 320 нм в зависимости от конкретного состава стекла и содержания железа. Для натриево-кальциевого стекла пороговое значение обычно составляет 320–350 нм. Эти предельные значения означают, что кюветы из боросиликатного стекла непригодны для измерений при 280 нм (количественное определение белков по поглощению ароматических групп), 260 нм (количественное определение нуклеиновых кислот), 254 нм (контроль УФ-стерилизации) и 214–220 нм (поглощение пептидных связей и количественное определение белков в области низких длин волн). При использовании стеклянной кюветы для анализа белков при 280 нм само стекло вносит вклад в поглощение, равный примерно 0,3–0,8 а.е. которая варьируется между отдельными кюветами с номинально одинаковыми техническими характеристиками — систематическая погрешность, зависящая от партии, которую невозможно скорректировать с помощью одного измерения в пустом пробе.

Каскад спектроскопических последствий: смещение базовой линии, вызванное температурно-зависимыми сдвигами поглощения стекла; кажущиеся пики поглощения на длинах волн, соответствующих границам поглощения стекла (которые могут быть ошибочно отнесены к хромофорам образца); а также суженный линейный динамический диапазон, из-за чего вся количественная оценка вынужденно проводится в верхней, нелинейной части кривой Бера-Ламберта.

Артефакты автофлюоресценции и рассеяния в стекле в ультрафиолетовом диапазоне длин волн

Помимо прямого поглощения, стеклянные кюветы создают вторичные оптические артефакты в УФ-диапазоне, которые ещё больше снижают точность измерений.

Автофлюоресценция стекла — спонтанное излучение видимого спектра, возникающее после УФ-возбуждения, — обусловлено электронными переходами в центрах структурных дефектов и органических примесях, попавших в стекло в процессе его производства. При облучении боросиликатного стекла излучением с длиной волны 280 нм оно излучает широкополосную флуоресценцию с пиком вблизи 400–450 нм, причем квантовые выходы варьируются в зависимости от партии стекла. В стандартном однолучевом УФ-Вис-спектрофотометре эта флуоресценция вносит вклад в регистрируемый сигнал на длинах волн, где полоса пропускания монохроматора перекрывается со спектром излучения, вызывая кажущееся снижение поглощения образца — артефакт, который изменяется нелинейно в зависимости от интенсивности возбуждения и отсутствует при измерениях пустого проба, проводимых с использованием одного только растворителя в кварцевой кювете.

Микроскопические включения в стекле — захваченные пузырьки газа, неперемешанные участки расплава и кристаллитные осадки — действуют как Центры рассеяния Миэ для УФ-излучения. Рассеяние Мие от сферических частиц, диаметр которых сопоставим с длиной волны измерения (100–300 нм для УФ-излучения), генерирует зависящий от длины волны фон, который резко возрастает в сторону более коротких длин волн, имитируя профиль поглощения коллоидных частиц. На практике стеклянная кювета, используемая для измерений при 220 нм, может демонстрировать кажущийся вклад в поглощение за счет рассеяния, превышающий 0,5 а.е. — превышает значение поглощения настоящего образца для многих разбавленных биологических образцов.

---

Сравнение характеристик пропускания света в кюветах из кварцевого стекла, пластика и сапфира

Для выбора подходящего материала кюветы необходимо провести систематическое сравнение всех четырёх классов материалов, доступных лабораторным спектроскопистам — плавленого кварца, боросиликатного стекла, полиметилметакрилата (ПММА) и сапфира — с учётом конкретных требований измерений в УФ-Вид-диапазоне.

Кварц из плавленого кремнезема обладает самым широким практическим диапазоном пропускания, наивысшей химической совместимостью и наилучшей оптической стабильностью поверхности среди этих четырёх материалов, при этом его удельная стоимость изготовления соответственно выше. Его пропускание в диапазоне от 170 нм до 2 700 нм с базовым поглощением < 0,01 AU при 260 нм делает его эталонным материалом, по которому оцениваются все остальные.

Боросиликатное стекло обеспечивает пропускание, сопоставимое с кварцем, в диапазоне выше 320 нм и во всем видимом диапазоне (400–800 нм), что делает его подходящим — и экономически выгодным — для колориметрических анализов, кинетики ферментативных реакций, контролируемой в видимом диапазоне, а также для любых измерений, не требующих доступа к УФ-излучению ниже 320 нм. Его граница пропускания в УФ-диапазоне около 290–320 нм и склонность к автофлуоресценции при УФ-облучении делают его неподходящим для использования в ближнем УФ-диапазоне.

ПММА и полистирол Кюветы представляют собой одноразовые изделия с предельными длинами волн УФ-излучения, равными 300–320 нм для ПММА и 340–360 нм для полистирола — ограничения, которые сводят их применение к колориметрии в видимом диапазоне. Их основными преимуществами являются цена и удобство: они позволяют избежать проблем с перекрестным загрязнением в клинических условиях и при высокопроизводительных измерениях, где обязательно использование одноразовых материалов. Органические растворители мгновенно растворяют пластиковые кюветы или вызывают на них появление трещин, а их поверхности, не отвечающие оптическим стандартам, приводят к значительному рассеиванию света. Сапфир (Al₂O₃) куветы пропускают свет в диапазоне примерно от от 145 нм до 5 500 нм обладающие исключительной химической стойкостью и механической твердостью (9 по шкале Мооса), что делает их технически более предпочтительными по сравнению с плавленым кварцем для применения в области вакуумного УФ-излучения с длиной волны менее 160 нм. Однако двулучепреломление сапфира — обусловленное его тригональной кристаллической структурой — затрудняет поляриметрические измерения, а сложность его изготовления ограничивает его применение специализированными научно-исследовательскими целями.

Сравнение коэффициентов пропускания и совместимости материалов кювет

Недвижимость	Кварц из плавленого кремнезема	Боросиликатное стекло	ПММА Пластик	Сапфир
Диапазон пропускания (нм)	170–2 700	320–2 500	300–900	145–5 500
Предельное значение УФ-излучения при 1,0 а.е. / 10 мм (нм)	< 175	290–320	300–320	< 150
Пригодно для использования при длине волны ниже 260 нм	✓ Да	✗ Нет	✗ Нет	✓ Да
Устойчивость к органическим растворителям	Превосходно	Хорошо	Бедный	Превосходно
Сопротивление ВЧ	✗ Нет	✗ Нет	✓ Да	✓ Да
Автофлюоресценция под УФ-излучением	Незначительный	Значительный	Умеренный	Незначительный
Твёрдость поверхности (по шкале Мооса)	7	6-7	3	9
Многоразовые	✓ Да	✓ Да	✗ Нет	✓ Да
Двулучепреломление	Нет	Нет	Нет	Присутствует

---

Распространенные погрешности измерений, связанные с материалом или состоянием кюветы

Даже при выборе кивета из подходящего материала погрешности измерений, связанные с состоянием кивета — царапины, остаточные загрязнения, неправильная ориентация и застрявшие пузырьки — остаются постоянным источником проблем с качеством данных в УФ-Вид-спектроскопии.

• Дрейф базовой линии и ненулевая поглощающая способность бланка являются наиболее часто встречающимися артефактами, связанными с кюветами. Когда для измерения бланка используется кварцевая кювета, на поверхности которой скопились загрязнения, в зарегистрированной базовой линии поглощение загрязнений учитывается как нулевое, в результате чего при всех последующих измерениях проб истинное поглощение занижается на ту же величину. Белковая пленка на оптической поверхности кварцевой кюветы может способствовать 0,05–0,2 а.е. видимой поглощающей способности при 280 нм — погрешность, достаточная для того, чтобы привести к занижению концентрации белка на 10–50% при стандартном анализе по методу Брэдфорда или прямом УФ-анализе. В отличие от этого, температурно-индуцированный дрейф базовой линии обусловлен особенностями самого образца, а не кюветы: показатель преломления водных растворов изменяется примерно на −0,0001 на °C, что приводит к смещению потерь на отражение по Френелю на границах раздела кивета и вызывает медленный дрейф оптической плотности, который отличается своей обратимостью после стабилизации температуры.

• Аномально повышенные показатели поглощения которые не соответствуют известным концентрациям образца, зачастую обусловлены рассеянием, вызванным царапинами на оптической поверхности кюветы, а не повышенной поглощающей способностью образца. Даже одна царапина, пересекающая поперечное сечение луча, может увеличить кажущуюся оптическую плотность на 0,05–0,5 а.е., в зависимости от глубины и ширины царапины, причем вклад рассеяния резко возрастает при более коротких длинах волн. Чтобы отличить рассеяние от царапины от истинного поглощения образца, необходимо провести измерение в киветке с кажущейся аномалией по сравнению с чистой эталонной киветкой с использованием того же пустого раствора; рассеяние от царапины будет проявляться в виде постоянного смещения базовой линии, тогда как истинное поглощение образца изменяется в зависимости от концентрации образца.

• Низкая воспроизводимость измерений — коэффициент вариации, превышающий 1–2% при повторных измерениях одних и тех же проб, — зачастую обусловлен неравномерной ориентацией кюветы при установке. Большинство кювет не являются идеально квадратными: колебания толщины стенок составляют ±0,01-0,05 мм Расположение между противоположными гранями изменяет эффективную длину пути в зависимости от того, какая грань обращена к лучу. Установка постоянной ориентации при вставке (отмеченной лабораторным маркером или путем совмещения с ориентационной меткой производителя) обычно позволяет снизить связанную с ориентацией изменчивость поглощения до значения ниже 0,3%.

• Артефакты в виде пузырьков вызывают внезапные, значительные скачки поглощения — зачастую превышающие 1,0 АЕ — на длинах волн, которые в остальном демонстрируют стабильное поведение. Пузырь, занимающий даже небольшую часть поперечного сечения луча, отражает практически всё падающее излучение в сторону, удаленную от детектора, что имитирует практически полное поглощение образца. Пузырьки образуются в результате выделения растворенного газа из раствора при переносе образцов из холодильника в условия комнатной температуры, при турбулентном введении образца через пипетки с узким просветом, а также из-за остатков промывочного растворителя, застрявших в плохо высушенных кюветах. Перед измерением необходимо аккуратно довести образец до комнатной температуры, медленно вводить его вдоль стенки кюветы, а не непосредственно в пучок света, а также тщательно просушивать кювету между использованием надежно предотвращают образование пузырьков.

---

Проверка целостности кварцевой кюветы для УФ-Вис перед каждым циклом измерений

Внедрение краткой процедуры проверки перед использованием кварцевой кюветы для УФ-Вис-спектроскопии в целях проведения количественных измерений позволяет предотвратить накопление нескорректированных систематических погрешностей в экспериментальных наборах данных.

• Проверка базовой передачи является наиболее информативной проверкой перед измерением. Заполнение кюветы водой для ВЭЖХ (или чистым растворителем, который будет использоваться в эксперименте) и сканирование в диапазоне от 190 нм до 350 нм с использованием воздуха в качестве эталона позволяет выявить как остаточные загрязнения (повышенная оптическая плотность на характерных длинах волн), так и поверхностное рассеяние (повышенная линия основания, равномерно нарастающая в сторону более коротких длин волн). Чистая кювета из плавленого кварца УФ-класса, заполненная водой для ВЭЖХ, должна демонстрировать поглощение ниже 0,05 а.е. при 200 нм, менее 0,02 а.е. при 230 нм и менее 0,01 а.е. при 260 нм по сравнению с пустым пробником в условиях стандартной спектрофотометрии. Отклонения, превышающие эти пороговые значения, указывают либо на остаточное загрязнение (требующее дополнительной очистки), либо на повреждение оптической поверхности (требующее замены кюветы).

• Визуальный осмотр при косом освещении дополняет спектрофотометрическую базовую проверку, позволяя выявить царапины, помутнения и механические сколы, которые вызывают рассеяние света, не давая при этом характерных спектральных пиков поглощения. Если держать кювету под углом примерно 30° к люминесцентной лампе или волоконно-оптическому источнику света и осматривать оптические поверхности в проходящем свете, царапины будут видны в виде ярких линейных полос; помутнения проявляются в виде рассеянного свечения внутри стеклянного корпуса; механические сколы выглядят как яркие области с острыми краями в углах или на краях кюветы. Любая кювета, на которой видны царапины в пределах центральная часть 80% оптической поверхности — область, через которую проходит луч спектрофотометра, — следует исключить из измерений при проведении количественных измерений.

• Проверка по сопоставленным парам требуется при использовании двухлучевых спектрофотометров с отдельными кюветами для образца и эталона. Заполнение обеих кювет одинаковым раствором-бланком и измерение поглощения одной кюветы по отношению к другой в диапазоне 200–400 нм позволяет количественно оценить их фотометрическую эквивалентность. Соответствующая пара должна демонстрировать разницу в поглощении, не превышающую 0,005 а.е. во всем диапазоне длин волн; пары, превышающие Разница в коэффициенте пропускания 0,5% на любой длине волны в пределах диапазона измерения следует повторно подобрать или заменить, поскольку несоответствие приводит к появлению зависящей от длины волны погрешности базовой линии, которую невозможно свести к нулю с помощью одного измерения в пустом режиме.

• Критерии замены Срок службы кварцевых кювет для УФ-Вид-спектрофотометрии определяется их оптическими характеристиками, а не хронологическим возрастом или количеством циклов использования. Кювета, прошедшая проверку базовой пропускаемости и визуальный осмотр, продолжает обеспечивать достоверные измерения независимо от того, как долго она находится в эксплуатации. И наоборот, кювета, не прошедшая проверку базовой пропускаемости несмотря на тщательную очистку — демонстрирующая устойчиво повышенную поглощающую способность выше 0,05 а.е. при 260 нм в растворителе для ВЭЖХ — имеет необратимое ухудшение оптических характеристик поверхности и не должно использоваться для количественных измерений в УФ-Вид-диапазоне.

---

Заключение

Выбор материала для кювет УФ-Вид — это решение, которое напрямую влияет на достоверность данных во всем спектральном диапазоне. Кварц из плавленого кремнезема выгодно отличается от стекла, пластика и большинства конкурирующих материалов благодаря своей молекулярной структуре — непрерывной сети SiO₂ с электронной запрещенной зоной 8,9 эВ — которая пропускает излучение в диапазоне от 170 нм до 2700 нм без поглощения, автофлуоресценции или деградации поверхности в присутствии кислот и органических растворителей. Стеклянные кюветы не подходят для измерений ниже 320 нм из-за примесей переходных металлов, структурных дефектов и многокомпонентного состава оксидов, которые приводят к поглощению УФ-излучения, дрейфу базовой линии и флуоресцентным артефактам. Правильный выбор кюветы, соответствующий требованиям к длине пути, геометрии и очистке, не является второстепенным аспектом УФ-Вид-спектроскопии — это физическая основа, на которой базируется каждый количественный результат.

---

ЧАСТО ЗАДАВАЕМЫЕ ВОПРОСЫ

Можно ли использовать стеклянную кювету для любых измерений в УФ-Вид-диапазоне?
Стеклянные кюветы подходят для измерений, проводимых исключительно в диапазоне выше 320 нм — колориметрии в видимом диапазоне, определения кинетики ферментативных реакций при 400–800 нм, а также измерений мутности по поглощению. Они не подходят для любых измерений, требующих доступа к длинам волн ниже 320 нм, включая количественный анализ белков при 280 нм, количественный анализ нуклеиновых кислот при 260 нм или любые анализы, зависящие от поглощения ароматических или пептидных связей в ближнем УФ-диапазоне.

Какая кварцевая кювета с какой длиной пути прохождения света является стандартной для большинства задач в области УФ-Вид?
Кварцевая кювета с длиной пути 10 мм является универсальным стандартом, поскольку обеспечивает практический рабочий диапазон поглощения примерно от 0,05 до 1,5 АЕ для концентраций образцов, характерных для большинства биологических и химических анализов, непосредственно соответствует длине пути, принятой в табличных значениях молярного коэффициента ослабления (которые обычно указываются в единицах L mol⁻¹ cm⁻¹, где 1 см = 10 мм), и совместима с оптической геометрией практически всех коммерческих настольных спектрофотометров.

Как часто следует заменять кварцевую кювету?
Частота замены определяется оптическими характеристиками, а не календарным сроком. Кварцевая кювета, прошедшая испытание на пропускание базовой линии — с показателем менее 0,05 АЕ при 260 нм в растворителе для ВЭЖХ — и не имеющая царапин в центральной области оптической поверхности, может оставаться в эксплуатации неограниченное время. Необходимость замены возникает, когда стойкое повышение поглощения базовой линии выше этого порога сохраняется даже после тщательной очистки, что подтверждает необратимое повреждение поверхности.

Существует ли какой-либо материал для кювет, который превосходит кварц по своим характеристикам при работе в УФ-Вид-диапазоне?
Сапфир (Al₂O₃) обладает более широким диапазоном пропускания, чем плавленый кварц, — от примерно 145 нм в вакуумном УФ-диапазоне до 5 500 нм в среднем инфракрасном диапазоне. Однако для лабораторных применений в УФ-Вис-диапазоне, ограниченных диапазоном 190–800 нм, плавленый кварц демонстрирует характеристики, сопоставимые с сапфиром, при этом позволяя избежать присущего сапфиру двулучепреломления — свойства, которое затрудняет поляриметрические измерения и измерения кругового дихроизма, — что делает плавленый кварц УФ-класса оптимальным практическим выбором для подавляющего большинства спектроскопических приложений в УФ-Вис-диапазоне.

---

Ссылки: