{"id":11186,"date":"2026-04-20T02:00:47","date_gmt":"2026-04-19T18:00:47","guid":{"rendered":"https:\/\/toquartz.com\/?p=11186"},"modified":"2026-02-25T15:32:50","modified_gmt":"2026-02-25T07:32:50","slug":"how-to-validate-a-quartz-96-well-plate-for-accurate-uv-absorbance-data","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/toquartz.com\/pt\/how-to-validate-a-quartz-96-well-plate-for-accurate-uv-absorbance-data\/","title":{"rendered":"Como validar uma placa de quartzo de 96 po\u00e7os para obter dados precisos de absorb\u00e2ncia de UV"},"content":{"rendered":"

A maioria dos laborat\u00f3rios presume que os leitores de placas fornecem dados precisos de UV por padr\u00e3o, mas erros sistem\u00e1ticos atribu\u00eddos a microplacas de quartzo n\u00e3o validadas comprometem rotineiramente os fluxos de trabalho de quantifica\u00e7\u00e3o de \u00e1cidos nucleicos e prote\u00ednas.<\/p>\n

Valida\u00e7\u00e3o de placas de quartzo de 96 po\u00e7os<\/a> O uso de um instrumento de medi\u00e7\u00e3o de absor\u00e7\u00e3o de UV em 260 nm e 280 nm n\u00e3o \u00e9 opcional em ambientes regulamentados ou de precis\u00e3o cr\u00edtica. Este artigo oferece uma estrutura de valida\u00e7\u00e3o completa, passo a passo, que abrange a f\u00edsica \u00f3ptica, o acoplamento de instrumentos, a calibra\u00e7\u00e3o do comprimento do caminho, a linearidade, a precis\u00e3o, a exatid\u00e3o, as considera\u00e7\u00f5es espec\u00edficas da prote\u00edna, a qualifica\u00e7\u00e3o da limpeza e a documenta\u00e7\u00e3o - estruturada de modo que uma \u00fanica leitura forne\u00e7a todas as respostas necess\u00e1rias para executar um protocolo compat\u00edvel e reproduz\u00edvel.<\/p>\n

Os cap\u00edtulos seguintes seguem uma l\u00f3gica experimental rigorosa: a l\u00f3gica f\u00edsica precede a avalia\u00e7\u00e3o do instrumento, a avalia\u00e7\u00e3o do instrumento precede a quantifica\u00e7\u00e3o da linha de base e a calibra\u00e7\u00e3o precede a execu\u00e7\u00e3o da valida\u00e7\u00e3o propriamente dita. Cada cap\u00edtulo se baseia diretamente no anterior, garantindo que nenhuma etapa do procedimento seja executada sem que seu pr\u00e9-requisito seja estabelecido.<\/p>\n

\n

\"Placa<\/p>\n

Por que as placas de quartzo de 96 po\u00e7os exigem um protocolo de valida\u00e7\u00e3o dedicado<\/h2>\n

Entre todos os materiais de substrato de microplacas avaliados em fluxos de trabalho de UV de alta sensibilidade, a s\u00edlica fundida ocupa consistentemente uma categoria \u00f3ptica distinta - e essa distin\u00e7\u00e3o cria vari\u00e1veis de medi\u00e7\u00e3o que os protocolos gen\u00e9ricos de leitura de placas simplesmente n\u00e3o foram projetados para abordar.<\/p>\n

O comportamento \u00f3ptico da s\u00edlica fundida versus borossilicato e substratos pl\u00e1sticos<\/h3>\n

A s\u00edlica fundida transmite radia\u00e7\u00e3o UV na faixa de 190 a 400 nm com uma transmit\u00e2ncia superior a 92% a 260 nm<\/strong>O vidro de borosilicato \u00e9 uma janela de desempenho que nem o vidro de borosilicato nem o poliestireno padr\u00e3o conseguem reproduzir. O vidro de borosilicato apresenta um corte acentuado de absor\u00e7\u00e3o de UV pr\u00f3ximo a 310 nm<\/strong>tornando-o funcionalmente opaco para a detec\u00e7\u00e3o de \u00e1cido nucleico a 260 nm sem revestimentos especializados. O poliestireno, o material dominante nas microplacas padr\u00e3o, absorve fortemente abaixo de 320 nm<\/strong> e gera um fundo de autofluoresc\u00eancia que aumenta as leituras de absorb\u00e2ncia aparente em 0,05-0,15 UA<\/strong> dependendo da geometria da excita\u00e7\u00e3o.<\/p>\n

A consequ\u00eancia desse contraste de material \u00e9 fundamental: os protocolos de valida\u00e7\u00e3o desenvolvidos para placas de poliestireno ou borossilicato codificam suposi\u00e7\u00f5es sobre a transmit\u00e2ncia do substrato, a autofluoresc\u00eancia e a qu\u00edmica da superf\u00edcie que n\u00e3o s\u00e3o transferidas para os sistemas de placas de 96 po\u00e7os de quartzo. A aplica\u00e7\u00e3o de um protocolo validado por poliestireno a uma placa de s\u00edlica fundida sem revalida\u00e7\u00e3o introduz um erro sistem\u00e1tico n\u00e3o quantificado em todos os comprimentos de onda abaixo de 320 nm.<\/strong> Os laborat\u00f3rios que caracterizaram esse erro de substitui\u00e7\u00e3o relatam desvios aparentes de A260 de 3-8%<\/strong> em rela\u00e7\u00e3o \u00e0s medi\u00e7\u00f5es de refer\u00eancia baseadas em cubeta - uma magnitude suficiente para classificar erroneamente a pureza do DNA ou estimar erroneamente a concentra\u00e7\u00e3o de RNA em aplica\u00e7\u00f5es posteriores.<\/p>\n

Al\u00e9m disso, o \u00edndice de refra\u00e7\u00e3o da s\u00edlica fundida (n \u2248 1,46 a 589 nm<\/strong>) \u00e9 diferente do poliestireno (n \u2248 1.59<\/strong>), alterando a geometria de reflex\u00e3o interna na base do po\u00e7o e produzindo uma diverg\u00eancia mensur\u00e1vel no comprimento efetivo do caminho, mesmo quando os volumes nominais de preenchimento s\u00e3o id\u00eanticos.<\/p>\n

Variabilidade de lote para lote no comprimento do caminho \u00f3ptico entre as posi\u00e7\u00f5es do po\u00e7o<\/h3>\n

As toler\u00e2ncias de fabrica\u00e7\u00e3o na produ\u00e7\u00e3o de placas de 96 po\u00e7os de quartzo introduzem uma varia\u00e7\u00e3o dimensional na planaridade do fundo do po\u00e7o e na espessura da parede que modula diretamente o comprimento do caminho \u00f3ptico visto pelo detector do leitor de placas. Em uma \u00fanica placa, a varia\u00e7\u00e3o da espessura do fundo do po\u00e7o de \u00b115-25 \u00b5m<\/strong> foi medida por inspe\u00e7\u00e3o profilom\u00e9trica em placas de s\u00edlica fundida dispon\u00edveis no mercado - uma faixa que se traduz em uma variabilidade de absorb\u00e2ncia aparente de \u00b10,008-0,012 AU<\/strong> em uma leitura A260 de 0,5.<\/p>\n

Entre os lotes de produ\u00e7\u00e3o do mesmo fabricante, essa variabilidade pode exceder 40 \u00b5m<\/strong>particularmente quando a placa \u00e9 fabricada por retifica\u00e7\u00e3o de precis\u00e3o em vez de polimento \u00f3ptico. Como os c\u00e1lculos de Beer-Lambert pressup\u00f5em um comprimento de caminho fixo e conhecido, qualquer varia\u00e7\u00e3o n\u00e3o compensada na geometria do fundo do po\u00e7o introduz um erro de concentra\u00e7\u00e3o proporcional em cada quantifica\u00e7\u00e3o realizada nessa placa. A caracteriza\u00e7\u00e3o espec\u00edfica do lote \u00e9, portanto, um pr\u00e9-requisito, n\u00e3o uma pr\u00e1tica recomendada.<\/p>\n

Dados emp\u00edricos de estudos de qualifica\u00e7\u00e3o de placas de v\u00e1rios lotes mostram que vi\u00e9s posicional - a tend\u00eancia sistem\u00e1tica de linhas ou colunas de po\u00e7os espec\u00edficos para leitura consistentemente maior ou menor do que a m\u00e9dia da placa - \u00e9 reproduz\u00edvel em um lote, mas n\u00e3o previs\u00edvel em todos os lotes<\/strong>. Essa descoberta confirma que uma \u00fanica tabela de corre\u00e7\u00e3o de comprimento de caminho validada por lote n\u00e3o pode ser aplicada com seguran\u00e7a a um novo lote de produ\u00e7\u00e3o sem nova medi\u00e7\u00e3o.<\/p>\n

Variabilidade do acoplamento instrumento-placa em leitores de placas de m\u00faltiplos po\u00e7os<\/h3>\n

A arquitetura do leitor de placas introduz um segundo eixo de variabilidade que \u00e9 independente do material da placa. A dist\u00e2ncia vertical entre o ponto focal da l\u00e2mpada e o menisco do l\u00edquido, o n\u00famero f da \u00f3ptica de coleta e a calibra\u00e7\u00e3o mec\u00e2nica da altura Z do suporte da placa variam entre os modelos de instrumentos e, em instrumentos sem foco Z automatizado, entre unidades individuais do mesmo modelo.<\/p>\n

Os instrumentos Tecan Spark com monocromadores Nano-Grating operam em uma largura de banda espectral de 1 nm<\/strong> no modo de alta resolu\u00e7\u00e3o, enquanto os instrumentos BioTek Synergy HTX operam em 2-4 nm<\/strong> dependendo da configura\u00e7\u00e3o da roda do filtro. Em uma largura de banda de 4 nm centrada em 260 nm, o A260 aparente de uma amostra de dsDNA de 50 ng\/\u00b5L \u00e9 sistematicamente subestimado em aproximadamente 4-6% em rela\u00e7\u00e3o a uma medi\u00e7\u00e3o de largura de banda de 1 nm<\/strong>porque o pico de absor\u00e7\u00e3o do dsDNA em 258 nm \u00e9 suficientemente estreito em termos de espectro para ser dilu\u00eddo por contribui\u00e7\u00f5es de luz fora do pico. Essa distor\u00e7\u00e3o espectral dependente do instrumento deve ser caracterizada durante a valida\u00e7\u00e3o e n\u00e3o pode ser considerada constante entre leitores da mesma marca.<\/p>\n

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Avalia\u00e7\u00e3o de compatibilidade de instrumentos para uma placa de 96 po\u00e7os de quartzo<\/h3>\n

Antes de qualquer amostra ser pipetada em uma placa de quartzo de 96 po\u00e7os para medi\u00e7\u00e3o de UV, as caracter\u00edsticas f\u00edsicas e fotom\u00e9tricas do leitor de placas pretendido devem ser verificadas em rela\u00e7\u00e3o aos requisitos de desempenho do ensaio.<\/p>\n

Requisitos de largura de banda espectral e precis\u00e3o de comprimento de onda em 260 e 280 nm<\/h3>\n

O m\u00e1ximo de absor\u00e7\u00e3o do DNA de fita dupla ocorre em 258 nm<\/strong>enquanto o RNA de fita simples atinge picos mais pr\u00f3ximos de 260-261 nm<\/strong>A absor\u00e7\u00e3o de amino\u00e1cidos arom\u00e1ticos usada para quantifica\u00e7\u00e3o de prote\u00ednas em 280 nm corresponde a uma banda mais ampla com uma meia largura de aproximadamente 20 nm<\/strong>. Essas caracter\u00edsticas espectrais imp\u00f5em requisitos distintos de toler\u00e2ncia de largura de banda ao leitor de placas usado com uma placa de quartzo de 96 po\u00e7os para cada aplica\u00e7\u00e3o.<\/p>\n

Para quantifica\u00e7\u00e3o de \u00e1cido nucleico a 260 nm, uma largura de banda espectral \u22642 nm \u00e9 necess\u00e1ria para manter o erro de medi\u00e7\u00e3o A260 abaixo de 3%<\/strong>. Na largura de banda de 4 nm, a absorb\u00e2ncia efetiva \u00e9 reduzida porque os comprimentos de onda fora do pico contribuem com coeficientes de absor\u00e7\u00e3o mais baixos para o sinal m\u00e9dio. Na largura de banda de 1 nm, a precis\u00e3o do comprimento de onda se torna o termo de erro dominante, e os instrumentos devem ser verificados em rela\u00e7\u00e3o a um padr\u00e3o de comprimento de onda de \u00f3xido de h\u00f3lmio certificado (NIST SRM 2034 ou equivalente) para confirmar que o ponto de ajuste de 260 nm n\u00e3o se desvia mais do que \u00b10,5 nm<\/strong>. Um deslocamento de comprimento de onda de 1 nm em 260 nm produz um erro A260 de aproximadamente 1,2-1,8%<\/strong> para uma amostra de dsDNA a 100 ng\/\u00b5L.<\/p>\n

A verifica\u00e7\u00e3o da precis\u00e3o do comprimento de onda deve ser realizada no instrumento real usado para a leitura da placa, e n\u00e3o presumida a partir do certificado de calibra\u00e7\u00e3o de f\u00e1brica do fabricante<\/strong>porque o desvio do monocromador de 0,3-0,8 nm foi documentado em instrumentos que operam por mais de 18 meses sem recalibra\u00e7\u00e3o.<\/p>\n

Geometria do caminho \u00f3ptico de leitura inferior versus leitura superior<\/h3>\n

Os leitores de placas com leitura inferior direcionam o feixe \u00f3ptico atrav\u00e9s da base do po\u00e7o, o que significa que o comprimento do caminho medido inclui a altura da coluna de l\u00edquido acima da base do po\u00e7o mais qualquer contribui\u00e7\u00e3o do menisco. A geometria de leitura superior direciona o feixe para baixo, atrav\u00e9s do menisco e de toda a coluna de l\u00edquido, com o feixe terminando na interface l\u00edquido-ar no lado oposto ou, em algumas configura\u00e7\u00f5es, refletindo no suporte da placa.<\/p>\n

No modo de leitura de fundo, a espessura do fundo do po\u00e7o da placa de quartzo de 96 po\u00e7os contribui diretamente para o caminho \u00f3ptico total, adicionando uma compensa\u00e7\u00e3o de absorb\u00e2ncia fixa de aproximadamente 0,003-0,008 AU, dependendo da espessura do vidro e do comprimento de onda UV.<\/strong> Essa compensa\u00e7\u00e3o deve ser subtra\u00edda durante a corre\u00e7\u00e3o do branco. O n\u00e3o uso de um branco compat\u00edvel com o volume na mesma placa e execu\u00e7\u00e3o propagar\u00e1 essa compensa\u00e7\u00e3o como um vi\u00e9s positivo sistem\u00e1tico em todas as leituras de amostra.<\/p>\n

A geometria de leitura superior evita a contribui\u00e7\u00e3o do fundo do po\u00e7o, mas introduz uma incerteza no comprimento da trajet\u00f3ria relacionada ao menisco de \u00b12-5%<\/strong> em volumes de preenchimento abaixo de 100 \u00b5L, porque o menisco convexo formado por tamp\u00f5es aquosos em po\u00e7os de s\u00edlica fundida hidrof\u00edlica reduz o caminho efetivo no centro da placa em rela\u00e7\u00e3o \u00e0s paredes do po\u00e7o. A valida\u00e7\u00e3o deve incluir uma caracteriza\u00e7\u00e3o do efeito do menisco em toda a faixa de volume de enchimento planejada antes de se comprometer com o modo de leitura superior.<\/p>\n

Efeitos do controle de temperatura e da umidade nas leituras de UV<\/h3>\n

A expans\u00e3o t\u00e9rmica da s\u00edlica fundida \u00e9 caracterizada por um coeficiente linear de 0.55 \u00d7 10-\u2076 \/\u00b0C<\/strong> - aproximadamente 8 vezes menor do que o vidro borossilicato, o que significa que as altera\u00e7\u00f5es dimensionais na placa de quartzo devido \u00e0 varia\u00e7\u00e3o de temperatura na c\u00e2mara do instrumento s\u00e3o insignificantes na faixa de 20 a 37 \u00b0C usada na maioria das incuba\u00e7\u00f5es de ensaios.<\/p>\n

No entanto, A principal preocupa\u00e7\u00e3o t\u00e9rmica nos ensaios de UV em microplacas de quartzo n\u00e3o \u00e9 a expans\u00e3o da placa, mas a evapora\u00e7\u00e3o do l\u00edquido<\/strong>. A 37\u00b0C com uma umidade da c\u00e2mara abaixo de 40% RH, um po\u00e7o de 100 \u00b5L descoberto perde aproximadamente 0,8-1,2 \u00b5L por hora<\/strong> por evapora\u00e7\u00e3o, reduzindo a altura da coluna de l\u00edquido e diminuindo o comprimento efetivo do caminho durante uma medi\u00e7\u00e3o de curso de tempo. Uma redu\u00e7\u00e3o do comprimento da trajet\u00f3ria de 1,1 \u00b5L em um po\u00e7o com di\u00e2metro interno de 6,35 mm corresponde a aproximadamente 35 \u00b5m<\/strong> de perda de altura da coluna, produzindo uma diminui\u00e7\u00e3o aparente de A260 de 0,007-0,010 AU<\/strong> em uma hora - equivalente a uma subestima\u00e7\u00e3o de ~2,5 ng\/\u00b5L da concentra\u00e7\u00e3o de DNA nas concentra\u00e7\u00f5es t\u00edpicas do ensaio. Os protocolos validados devem especificar se a placa est\u00e1 coberta, a temperatura de incuba\u00e7\u00e3o e a dura\u00e7\u00e3o m\u00e1xima permitida da medi\u00e7\u00e3o<\/strong> para evitar que a evapora\u00e7\u00e3o introduza uma tend\u00eancia dependente do tempo.<\/p>\n

Par\u00e2metros de compatibilidade do instrumento<\/h4>\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n
Par\u00e2metro<\/th>\n\u00c1cido nucleico (260 nm)<\/th>\nProte\u00edna (280 nm)<\/th>\nLimite de aceita\u00e7\u00e3o<\/th>\n<\/tr>\n<\/thead>\n
Largura de banda espectral (nm)<\/td>\n\u22642<\/td>\n\u22644<\/td>\nDe acordo com o aplicativo acima<\/td>\n<\/tr>\n
Precis\u00e3o do comprimento de onda (nm)<\/td>\n\u00b10.5<\/td>\n\u00b11.0<\/td>\nNIST SRM 2034 verificado<\/td>\n<\/tr>\n
Reprodutibilidade da altura Z (\u00b5m)<\/td>\n\u00b150<\/td>\n\u00b150<\/td>\nEspecifica\u00e7\u00f5es do fabricante<\/td>\n<\/tr>\n
Modo de leitura<\/td>\nPreferido na parte inferior<\/td>\nPreferido na parte inferior<\/td>\nEm branco<\/td>\n<\/tr>\n
Umidade da c\u00e2mara (%RH)<\/td>\n50-70<\/td>\n50-70<\/td>\nPreferencialmente, prato coberto<\/td>\n<\/tr>\n
Estabilidade de temperatura (\u00b0C)<\/td>\n\u00b10.5<\/td>\n\u00b10.5<\/td>\nPr\u00e9-equilibra\u00e7\u00e3o \u226515 min<\/td>\n<\/tr>\n<\/tbody>\n<\/table>\n
\n

\"Placa<\/p>\n

Estabelecimento da uniformidade da absorb\u00e2ncia da linha de base em toda a placa<\/h2>\n

A uniformidade fotom\u00e9trica em todas as 96 posi\u00e7\u00f5es dos po\u00e7os \u00e9 a base quantitativa sobre a qual repousam todos os c\u00e1lculos de concentra\u00e7\u00e3o subsequentes; sem uma linha de base caracterizada e de baixo CV, todos os dados de absorb\u00e2ncia coletados da placa carregam uma incerteza espacial n\u00e3o resolvida.<\/p>\n

Protocolo de subtra\u00e7\u00e3o de branco usando \u00e1gua ultrapura como refer\u00eancia<\/h3>\n

O l\u00edquido de refer\u00eancia usado para a subtra\u00e7\u00e3o do branco em ensaios de placa UV deve atender a dois crit\u00e9rios simultaneamente: deve ser transparente em toda a faixa de comprimento de onda da medi\u00e7\u00e3o e deve corresponder ao \u00edndice de refra\u00e7\u00e3o do tamp\u00e3o da amostra de forma suficientemente pr\u00f3xima para evitar diferen\u00e7as sistem\u00e1ticas na geometria do menisco. A \u00e1gua ultrapura (resistividade \u226518,2 M\u03a9-cm, TOC \u22645 ppb) atende a ambos os crit\u00e9rios para tamp\u00f5es aquosos de \u00e1cido nucleico e prote\u00edna e \u00e9 a refer\u00eancia em branco internacionalmente aceita para medi\u00e7\u00f5es de absorb\u00e2ncia a 260 e 280 nm.<\/strong><\/p>\n

A precis\u00e3o da pipetagem durante o carregamento do branco tem um impacto desproporcional na uniformidade da linha de base. Um volume de preenchimento de 100 \u00b5L fornecido com um \u00b10,5 \u00b5L<\/strong> A precis\u00e3o corresponde a uma incerteza de comprimento de trajet\u00f3ria de aproximadamente \u00b116 \u00b5m<\/strong> - gerando uma varia\u00e7\u00e3o A260 entre po\u00e7os de \u00b10,0005 AU<\/strong> atribu\u00edvel somente \u00e0 pipetagem, que est\u00e1 dentro do ru\u00eddo de linha de base aceit\u00e1vel. No entanto, quando pipetas multicanais com varia\u00e7\u00e3o de volume de ponta a ponta superior a \u00b12 \u00b5L<\/strong> s\u00e3o usados, o CV de linha de base resultante pode chegar a 0,8-1,2%<\/strong> antes que qualquer varia\u00e7\u00e3o relacionada \u00e0 amostra seja introduzida. Portanto, recomenda-se o uso de ponteiras calibradas e testadas individualmente ou aspira\u00e7\u00f5es de rob\u00f4s de manuseio de l\u00edquidos para a prepara\u00e7\u00e3o do branco na caracteriza\u00e7\u00e3o da linha de base da placa de 96 po\u00e7os de quartzo.<\/p>\n

Deve-se permitir que a placa em branco se equilibre \u00e0 temperatura do instrumento por um m\u00ednimo de 10 minutos<\/strong> antes da medi\u00e7\u00e3o para eliminar gradientes de \u00edndice de refra\u00e7\u00e3o induzidos termicamente na coluna de \u00e1gua, o que pode produzir varia\u00e7\u00f5es aparentes de A260 de at\u00e9 0,003 AU na placa quando uma placa fria \u00e9 lida imediatamente ap\u00f3s o carregamento.<\/p>\n

Crit\u00e9rios de aceita\u00e7\u00e3o para CV entre po\u00e7os a 260 nm<\/h3>\n

Uma vez adquirida a matriz de absorb\u00e2ncia da placa em branco, o coeficiente de varia\u00e7\u00e3o (CV) em todos os 96 po\u00e7os \u00e9 calculado como a raz\u00e3o entre o desvio padr\u00e3o e a absorb\u00e2ncia m\u00e9dia, expressa em porcentagem. Para uma placa de quartzo de 96 po\u00e7os bem caracterizada em um ambiente de ensaio validado, o CV do branco entre po\u00e7os a 260 nm n\u00e3o deve exceder 2,0%<\/strong>Para a quantifica\u00e7\u00e3o de alta precis\u00e3o de \u00e1cidos nucleicos em concentra\u00e7\u00f5es abaixo de 10 ng\/\u00b5L, um limite mais rigoroso de \u22641,0% CV<\/strong> \u00e9 adequado, pois a rela\u00e7\u00e3o sinal-fundo nessas concentra\u00e7\u00f5es torna o ru\u00eddo da linha de base uma fonte dominante de incerteza.<\/p>\n

Os po\u00e7os que apresentam valores de absorb\u00e2ncia com desvio superior a 3\u00d7 o desvio padr\u00e3o entre po\u00e7os<\/strong> da m\u00e9dia da placa s\u00e3o sinalizados como discrepantes e exclu\u00eddos do carregamento subsequente de amostras. As causas comuns de outliers de po\u00e7os individuais no est\u00e1gio de branco incluem detritos microsc\u00f3picos na base do po\u00e7o, contaminantes residuais da fabrica\u00e7\u00e3o, microbolhas de ar aprisionadas durante o preenchimento e arranh\u00f5es localizados na superf\u00edcie da base de s\u00edlica fundida<\/strong>. Quando mais de 4 po\u00e7os em uma placa de 96 po\u00e7os falham no crit\u00e9rio de outlier, a placa \u00e9 rejeitada para uso, pois esse padr\u00e3o normalmente indica um defeito de fabrica\u00e7\u00e3o ou armazenamento inadequado.<\/p>\n

Notavelmente, os po\u00e7os de borda (coluna 1, coluna 12, linha A, linha H) exibem consistentemente 5-15% maior CV em branco<\/strong> do que os po\u00e7os internos em v\u00e1rias marcas de placas, o que pode ser atribu\u00eddo aos gradientes de temperatura e \u00e0s taxas de evapora\u00e7\u00e3o no per\u00edmetro da placa. Os projetos de protocolo para ensaios quantitativos devem considerar a exclus\u00e3o dos po\u00e7os de borda das posi\u00e7\u00f5es de amostra ou a aplica\u00e7\u00e3o de fatores de corre\u00e7\u00e3o espec\u00edficos da posi\u00e7\u00e3o derivados durante essa etapa de caracteriza\u00e7\u00e3o da linha de base.<\/p>\n

Mapeamento espacial do vi\u00e9s de absorb\u00e2ncia em posi\u00e7\u00f5es de 96 po\u00e7os<\/h3>\n

Um mapa de calor de absorb\u00e2ncia espacial - gerado pela plotagem do valor bruto de A260 do branco para cada uma das 96 posi\u00e7\u00f5es do po\u00e7o como uma matriz de cores falsas - revela padr\u00f5es estruturados de polariza\u00e7\u00e3o posicional que uma \u00fanica estat\u00edstica CV resumida n\u00e3o consegue capturar. O padr\u00e3o observado com mais frequ\u00eancia \u00e9 um gradiente radial, em que os valores de absor\u00e7\u00e3o diminuem monotonicamente do per\u00edmetro da placa em dire\u00e7\u00e3o ao centro em 0,003-0,008 AU<\/strong>consistente com a espessura ligeiramente maior do fundo do po\u00e7o nas bordas da placa devido \u00e0 geometria da retifica\u00e7\u00e3o.<\/p>\n

Um segundo padr\u00e3o comumente observado \u00e9 um artefato de striping em linha<\/strong>em que as fileiras alternadas de po\u00e7os mostram uma m\u00e9dia A260 consistentemente maior ou menor do que as fileiras adjacentes em aproximadamente 0,002-0,004 AU. Esse padr\u00e3o \u00e9 caracter\u00edstico da dispensa\u00e7\u00e3o de pipetas multicanal com um deslocamento de calibra\u00e7\u00e3o em canais espec\u00edficos e n\u00e3o \u00e9 um defeito intr\u00ednseco da placa. Para distinguir entre os padr\u00f5es espaciais de origem da placa e de origem da pipeta, \u00e9 necess\u00e1rio repetir o preenchimento do espa\u00e7o em branco com uma pipeta diferente ou com um rob\u00f4 de manuseio de l\u00edquidos.<\/p>\n

Qualquer padr\u00e3o espacial que apresente um coeficiente de determina\u00e7\u00e3o R\u00b2 > 0,85 em uma regress\u00e3o linear de absorb\u00e2ncia em rela\u00e7\u00e3o ao \u00edndice de linha ou coluna indica um vi\u00e9s sistem\u00e1tico e corrig\u00edvel<\/strong> que devem ser incorporados ao modelo de corre\u00e7\u00e3o do comprimento do caminho em vez de serem descartados como ru\u00eddo aleat\u00f3rio. A captura desse mapa espacial como uma imagem de refer\u00eancia na documenta\u00e7\u00e3o de valida\u00e7\u00e3o fornece uma impress\u00e3o digital permanente de cada lote de produ\u00e7\u00e3o, permitindo a compara\u00e7\u00e3o direta com os dados de revalida\u00e7\u00e3o coletados ap\u00f3s os ciclos de limpeza e reutiliza\u00e7\u00e3o.<\/p>\n

Par\u00e2metros de aceita\u00e7\u00e3o da uniformidade da linha de base<\/h4>\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n
M\u00e9trico<\/th>\nEnsaio padr\u00e3o<\/th>\nEnsaio de alta sensibilidade<\/th>\nCrit\u00e9rio de rejei\u00e7\u00e3o<\/th>\n<\/tr>\n<\/thead>\n
CV em branco entre po\u00e7os a 260 nm (%)<\/td>\n\u22642.0<\/td>\n\u22641.0<\/td>\n>3.0<\/td>\n<\/tr>\n
CV em branco entre po\u00e7os a 280 nm (%)<\/td>\n\u22642.5<\/td>\n\u22641.2<\/td>\n>3.5<\/td>\n<\/tr>\n
Limite de outlier de um \u00fanico po\u00e7o<\/td>\nM\u00e9dia \u00b13 DP<\/td>\nM\u00e9dia \u00b12 DP<\/td>\n>4 po\u00e7os an\u00f4malos<\/td>\n<\/tr>\n
Gradiente da borda ao centro (AU)<\/td>\n\u22640.010<\/td>\n\u22640.005<\/td>\n>0.015<\/td>\n<\/tr>\n
Tempo de equil\u00edbrio do branco (min)<\/td>\n\u226510<\/td>\n\u226515<\/td>\n-<\/td>\n<\/tr>\n
Precis\u00e3o do volume de enchimento (\u00b5L)<\/td>\n\u00b11.0<\/td>\n\u00b10.5<\/td>\n\u00b12.0<\/td>\n<\/tr>\n<\/tbody>\n<\/table>\n
\n

\"Placa<\/p>\n

Calibra\u00e7\u00e3o do comprimento do caminho \u00f3ptico com uma placa de quartzo de 96 po\u00e7os<\/h2>\n

A calibra\u00e7\u00e3o do comprimento do caminho \u00e9 o componente tecnicamente mais exigente da valida\u00e7\u00e3o de UV em microplacas, porque o caminho \u00f3ptico efetivo em um formato de 96 po\u00e7os \u00e9 uma fun\u00e7\u00e3o do volume de preenchimento, da geometria do po\u00e7o e do modo de leitura - nenhum dos quais \u00e9 fixado no padr\u00e3o de 1.000 cm assumido na espectrofotometria baseada em cubeta.<\/p>\n

A Lei de Beer-Lambert aplicada \u00e0 geometria de microplacas<\/h3>\n

A lei de Beer-Lambert estabelece que A = \u03b5 \u00d7 c \u00d7 l<\/strong>onde A \u00e9 a absorb\u00e2ncia, \u03b5 \u00e9 o coeficiente de extin\u00e7\u00e3o molar (L-mol-\u00b9-cm-\u00b9), c \u00e9 a concentra\u00e7\u00e3o (mol-L-\u00b9) e l \u00e9 o comprimento do caminho (cm). Em uma cubeta padr\u00e3o de 1 cm, l \u00e9 definido pela geometria da cubeta e \u00e9 constante, independentemente do volume de preenchimento. Em uma placa de quartzo de 96 po\u00e7os com um po\u00e7o de fundo plano de Di\u00e2metro interno de 6,35 mm<\/strong>Se a coluna de l\u00edquido for de tamanho m\u00e9dio, o comprimento do caminho \u00e9 totalmente determinado pela altura da coluna de l\u00edquido, que varia de acordo com o volume de enchimento.<\/p>\n

Em um volume de preenchimento de 100 \u00b5L em uma placa padr\u00e3o de 96 po\u00e7os de fundo plano, o comprimento te\u00f3rico do caminho \u00e9 de aproximadamente 0,32 cm<\/strong> - aproximadamente um ter\u00e7o do padr\u00e3o da cubeta. Isso significa que os valores do coeficiente de extin\u00e7\u00e3o molar tabulados para medi\u00e7\u00f5es baseadas em cubeta (por exemplo, \u03b5\u2082\u2086\u2080 = 6.600 L-mol-\u00b9-cm-\u00b9 por nucleot\u00eddeo para ssDNA) devem ser multiplicados pela raz\u00e3o l_placa \/ 1 cm<\/strong> para produzir a absorb\u00e2ncia esperada no formato de microplaca. A n\u00e3o aplica\u00e7\u00e3o dessa convers\u00e3o produz um Subestima\u00e7\u00e3o de 3,1 vezes<\/strong> de concentra\u00e7\u00e3o quando os coeficientes de extin\u00e7\u00e3o derivados da cubeta s\u00e3o usados sem corre\u00e7\u00e3o do comprimento do caminho.<\/p>\n

O comprimento do caminho geom\u00e9trico \u00e9 um valor te\u00f3rico e n\u00e3o leva em conta os efeitos \u00f3pticos no menisco ou na base do po\u00e7o; portanto, a calibra\u00e7\u00e3o emp\u00edrica \u00e9 sempre necess\u00e1ria para estabelecer o verdadeiro comprimento do caminho efetivo para uma combina\u00e7\u00e3o espec\u00edfica de placa de instrumento.<\/p>\n

M\u00e9todo KBS para corre\u00e7\u00e3o de comprimento de caminho<\/h3>\n

O m\u00e9todo de corre\u00e7\u00e3o de comprimento de caminho mais amplamente adotado para ensaios aquosos explora a banda de absor\u00e7\u00e3o de \u00e1gua no infravermelho pr\u00f3ximo centrada em 977 nm<\/strong>onde A\u2089\u2087\u2087 \u00e9 proporcional ao comprimento do caminho com uma absortividade conhecida de 0,18 AU-cm-\u00b9<\/strong> para \u00e1gua pura a 25 \u00b0C. Medindo a absorb\u00e2ncia da refer\u00eancia de \u00e1gua corrigida pelo branco a 977 nm e dividindo por 0,18 AU-cm-\u00b9, o comprimento efetivo do caminho em cent\u00edmetros \u00e9 calculado diretamente: l = A\u2089\u2087\u2087 \/ 0,18<\/strong>.<\/p>\n

Esse m\u00e9todo exige que o leitor de placas seja equipado com um canal de detec\u00e7\u00e3o de infravermelho pr\u00f3ximo a 977 nm<\/strong>que \u00e9 padr\u00e3o nas plataformas Tecan Infinite M200 Pro, BioTek Synergy Neo2 e Molecular Devices SpectraMax i3x, mas ausente em leitores baseados em filtros sem o filtro de passagem de banda apropriado. Quando o canal de 977 nm n\u00e3o est\u00e1 dispon\u00edvel, a corre\u00e7\u00e3o pode ser aproximada usando o Faixa de \u00e1gua de 900 nm<\/strong> com uma capacidade de absor\u00e7\u00e3o de 0,053 AU-cm-\u00b9<\/strong>embora a incerteza de medi\u00e7\u00e3o aumente para aproximadamente \u00b14%<\/strong> em compara\u00e7\u00e3o com \u00b11,5%<\/strong> para o m\u00e9todo de 977 nm.<\/p>\n

O m\u00e9todo KBS \u00e9 v\u00e1lido exclusivamente para tamp\u00f5es aquosos com atividade de \u00e1gua > 0,95<\/strong>As amostras contendo solvente org\u00e2nico >10% (DMSO, etanol, metanol) exibem um espectro de absor\u00e7\u00e3o de \u00e1gua deslocado que invalida a constante de absortividade de 977 nm, exigindo uma curva de calibra\u00e7\u00e3o espec\u00edfica do solvente ou uma abordagem alternativa de determina\u00e7\u00e3o do comprimento do caminho geom\u00e9trico.<\/p>\n

Convers\u00e3o do volume para o comprimento da esteira para volumes de enchimento padr\u00e3o<\/h3>\n

Comprimento do caminho por volume de preenchimento em po\u00e7os de quartzo de fundo plano padr\u00e3o<\/h4>\n\n\n\n\n\n\n\n\n
Volume de enchimento (\u00b5L)<\/th>\nComprimento do caminho te\u00f3rico (cm)<\/th>\nComprimento do caminho corrigido por KBS (cm)<\/th>\nCV em 96 po\u00e7os (%)<\/th>\n<\/tr>\n<\/thead>\n
50<\/td>\n0.158<\/td>\n0.161 \u00b1 0.004<\/td>\n2.5<\/td>\n<\/tr>\n
100<\/td>\n0.315<\/td>\n0.320 \u00b1 0.005<\/td>\n1.6<\/td>\n<\/tr>\n
150<\/td>\n0.473<\/td>\n0.479 \u00b1 0.006<\/td>\n1.3<\/td>\n<\/tr>\n
200<\/td>\n0.630<\/td>\n0.638 \u00b1 0.007<\/td>\n1.1<\/td>\n<\/tr>\n<\/tbody>\n<\/table>\n

Birrefring\u00eancia residual e artefatos \u00f3pticos induzidos por estresse em quartzo<\/h3>\n

A s\u00edlica fundida fabricada por processos de fus\u00e3o por chama ou sol-gel ret\u00e9m a tens\u00e3o mec\u00e2nica residual dentro da rede de vidro, a menos que um ciclo de recozimento controlado reduza a temperatura fict\u00edcia para pr\u00f3ximo do equil\u00edbrio. Magnitudes de tens\u00e3o residual de 0,5 a 2,5 MPa foram relatadas em microplacas de quartzo dispon\u00edveis comercialmente<\/strong>, correspondendo a birrefring\u00eancia<\/a>1<\/a><\/sup> valores de retardamento de 3-15 nm por cent\u00edmetro de caminho \u00f3ptico<\/strong> - mensur\u00e1vel com um compensador S\u00e9narmont ou um polar\u00edmetro de cristal l\u00edquido.<\/p>\n

Em medi\u00e7\u00f5es de absorb\u00e2ncia baseadas em intensidade padr\u00e3o usando luz n\u00e3o polarizada, a birrefring\u00eancia n\u00e3o altera diretamente o valor A260 medido porque ambos os componentes de polariza\u00e7\u00e3o s\u00e3o absorvidos igualmente pelo crom\u00f3foro. No entanto, em instrumentos que usam excita\u00e7\u00e3o polarizada para anisotropia de fluoresc\u00eancia - ou em configura\u00e7\u00f5es de dicro\u00edsmo circular de UV em que placas de quartzo s\u00e3o ocasionalmente empregadas -, a birrefring\u00eancia n\u00e3o altera diretamente o valor A260 medido. o retardo da birrefring\u00eancia introduz uma rota\u00e7\u00e3o de polariza\u00e7\u00e3o sistem\u00e1tica que aumenta os valores de anisotropia aparente em 5 a 12 unidades de mili-anisotropia<\/strong> em n\u00edveis de tens\u00e3o acima de 1,5 MPa.<\/p>\n

A inspe\u00e7\u00e3o da birrefring\u00eancia de tens\u00e3o \u00e9 realizada colocando-se a placa entre polarizadores cruzados sob ilumina\u00e7\u00e3o de luz branca; as regi\u00f5es que apresentam estresse aparecem como franjas de interfer\u00eancia brilhantes contra o campo escuro<\/strong>enquanto as \u00e1reas livres de estresse permanecem uniformemente escuras. As placas que apresentam franjas de interfer\u00eancia em mais de 10% da \u00e1rea da base do po\u00e7o devem ser rejeitadas para medi\u00e7\u00f5es sens\u00edveis \u00e0 polariza\u00e7\u00e3o, embora permane\u00e7am \u00fateis para ensaios de absorb\u00e2ncia de UV baseados em intensidade padr\u00e3o.<\/p>\n

Compara\u00e7\u00e3o do m\u00e9todo de calibra\u00e7\u00e3o do comprimento do caminho<\/h4>\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n
M\u00e9todo de calibra\u00e7\u00e3o<\/th>\nRecurso de instrumento necess\u00e1rio<\/th>\nIncerteza (%)<\/th>\nSolvente aplic\u00e1vel<\/th>\n<\/tr>\n<\/thead>\n
KBS a 977 nm<\/td>\nCanal NIR em 977 nm<\/td>\n\u00b11.5<\/td>\nSomente aquoso<\/td>\n<\/tr>\n
KBS a 900 nm<\/td>\nCanal NIR em 900 nm<\/td>\n\u00b14.0<\/td>\nSomente aquoso<\/td>\n<\/tr>\n
C\u00e1lculo geom\u00e9trico<\/td>\nMedi\u00e7\u00e3o do di\u00e2metro do po\u00e7o<\/td>\n\u00b15-8<\/td>\nQualquer<\/td>\n<\/tr>\n
C\u00e1lculo retroativo da curva padr\u00e3o<\/td>\nQualquer leitor de UV<\/td>\n\u00b12.5<\/td>\nQualquer<\/td>\n<\/tr>\n
KBS a 977 nm (com corre\u00e7\u00e3o org\u00e2nica)<\/td>\nCalibra\u00e7\u00e3o de NIR + solvente<\/td>\n\u00b13.0<\/td>\nMisto aquoso\/org\u00e2nico<\/td>\n<\/tr>\n<\/tbody>\n<\/table>\n
\n

\"Placa<\/p>\n

Sele\u00e7\u00e3o do padr\u00e3o de refer\u00eancia para calibra\u00e7\u00e3o de ensaios de 260 nm e 280 nm<\/h2>\n

A sele\u00e7\u00e3o dos padr\u00f5es de refer\u00eancia adequados \u00e9 a pen\u00faltima etapa preparat\u00f3ria antes da execu\u00e7\u00e3o da valida\u00e7\u00e3o completa, e a escolha do padr\u00e3o determina diretamente se o m\u00e9todo validado \u00e9 rastre\u00e1vel a uma refer\u00eancia metrol\u00f3gica reconhecida.<\/p>\n

DNA do timo de bezerro (CT-DNA)<\/strong> \u00e9 o padr\u00e3o prim\u00e1rio mais amplamente usado para calibra\u00e7\u00e3o em 260 nm devido \u00e0 sua estrutura de fita dupla bem caracterizada, solu\u00e7\u00f5es de estoque certificadas dispon\u00edveis comercialmente e coeficiente de extin\u00e7\u00e3o de 6.600 L-mol-\u00b9-cm-\u00b9 por par de bases<\/strong> em pH neutro. No entanto, o CT-DNA apresenta variabilidade de lote para lote no conte\u00fado de GC (normalmente 42-45%), o que altera a rela\u00e7\u00e3o A260\/A230 e pode introduzir uma 3-5% varia\u00e7\u00e3o em \u03b5\u2082\u2086\u2080<\/strong> entre lotes; portanto, cada novo lote deve ser submetido a uma valida\u00e7\u00e3o cruzada com o lote certificado anterior ou com o NIST SRM 2366b (DNA gen\u00f4mico de Bacillus subtilis), que fornece um valor A260 certificado com uma incerteza de medi\u00e7\u00e3o combinada de \u00b10,8%<\/strong>. Os padr\u00f5es de oligonucleot\u00eddeos sint\u00e9ticos com sequ\u00eancias definidas com precis\u00e3o oferecem uma alternativa de maior precis\u00e3o quando o alvo do ensaio \u00e9 um oligonucleot\u00eddeo definido, porque \u03b5\u2082\u2086\u2080 pode ser calculado a partir de Termodin\u00e2mica do vizinho mais pr\u00f3ximo<\/a>2<\/a><\/sup> para dentro \u00b12%<\/strong> e verificado por an\u00e1lise elementar de f\u00f3sforo.<\/p>\n